目的 研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)改造的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与心室肌细胞共培养,构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性
童敏, 杨向军
苏州大学附属第一医院
目的 研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4(HCN4)改造的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)与心室肌细胞共培养,构建具有自律性的心脏生物起搏器模型的可行性;并研究MSC中过表达连接蛋白45(CX45)对以上生物起搏器模型自律性的影响。
方法1)体外分离培养新生大鼠的心室肌细胞,鉴定纯度及活力;并通过膜片钳方法记录心肌细胞的自发性动作电位。2)基因克隆的方法构建包含HCN4 基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4,并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒,转染大鼠的MSCs,构建成HCN4+MSCs;将仅转染有GFP 基因的慢病毒颗粒的MSCs 设为HCN4-MSCs。通过RT-PCR,以及荧光观察鉴定HCN4基因在MSCs 中的表达;电压钳记录阳性转染细胞的起搏电流If。3)将HCN4+MSCs 与乳鼠心室肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型,同时将HCN4-MSCs 与心肌细胞共培养设为“HCN4-MSCs 对照组”。为了监测生物起搏器的自律性,初步分析自律性变化的原因,计数心室肌细胞自发搏动频率、记录自发性动作电位;并通过免疫荧光标记等方法鉴定共培养的两类细胞间连接蛋白43(CX43)的表达;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸验证缝隙连接在模型中的价值。
结果1) 该方案分离培养的新生大鼠心室肌细胞消化瞬时的活细胞率为80%;培养至第5 天时85%左右的心肌细胞都有自发性搏动,搏动频率80 次/min 左右;培养至第9 天后心肌细胞纯度开始大大降低;培养5 天心肌细胞的自发性动作电位阈电位为-60mV, 频率84±12 次/分,节律不规则。2) 通过酶切鉴定以及基因测序证实HCN4 基因成功构建到pCDH1-MCS1- EF1-copGFP 质粒中,形成包含目的基因的穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN4;通过穿梭质粒的介导成功将HCN4 基因包装成慢病毒载体lentiv-GFP/HCN4,real-time PCR 测定lentiv-GFP/HCN4 滴度为3×10TU/mL。通过慢病毒载体介导HCN4 基因转染MSCs,5 天后,荧光显微镜下观察转染阳性率约70%;RT-PCR证实HCN4+MSCs 中有HCN4 mRNA 的表达;膜片钳记录到HCN4+MSCs 上有时间和电压依赖性的超极化激活的内向电流,该电流的激活阈电压为-70mV,对低浓度CS+敏感,符合If 的特征。至此说明,MSCs上已经成功表达有起搏离子通道HCN4。3) 将HCN4+MSCs 与3d 心肌细胞共培养2-4d后,发现实验组心肌细胞的自发搏动频率明显快于“HCN4-MSCs 对照组”中的心肌细胞自发搏动频率。膜片钳结果显示心肌细胞的自发动作电位频率显著提高(129±11 次/分vs. 82±8 次/分,P<0.05,n=5);动作电位频率变规则;动作电位最大舒张电位(MDP)绝对值降低(-66±6mV vs. -87±4mV,P<0.05);而实验组与对照组的阈电位均为-60mV左右。免疫荧光标记证实共培养的两类细胞相接触部位的膜上有CX43 的表达;加入缝隙连接阻断剂甘珀酸后,观察实验组心肌细胞的自发搏动频率明显降低,而且变的不规则。综上,HCN4 基因改造的MSCs 与心室肌细胞共培养,成功构建成具有自律性的心脏生物起搏器模型;缝隙连接在生物起搏器模型中具有重要价值。
结论 HCN4 基因改造的MSCs 与心室肌细胞共培养,成功构建成具有自律性的心脏生物起搏器模型;MSCs细胞膜上CX45 的高表达,使得以上生物起搏器模型的自律性提高。